GenCRISPR/Cas 9 Technology

研究发现,在细菌纲和古细菌纲中发现的规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR) ,能够定位并在基因水平上有效地抵抗噬菌体和外界各种基因元件对其造成的干扰。 CRISPR相关蛋白(Cas)是一种核酸内切酶,可以剪切外来DNA。只有当入侵的DNA中的目标序列中出现保守的间隔相邻基序(protospacer adjacent motif ,PAM)时,DNA 序列将被在PAM的上游定点切割。这一过程具有高度准确性。

CRISPR-Cas9系统灵活简单,特异性高,细胞毒性小,已经成为一项热门的基因组编辑技术,被广泛应用于基因组工程领域。

CRISPR-Cas 9 的应用包括:

  • 基因修复--很可能治愈遗传性疾病和危险因素
  • 基因中断--修正显性失活突变和入侵的病原体基因组
  • 基因抑制--抑制癌基因或宿主病毒受体,防止病毒感染
  • 基因激活--抑制肿瘤生长

图1. 应用CRISPR-Cas9系统定点编辑基因组

利用gRNA与DNA 接合定位目标宿主基因,gRNA识别宿主DNA的特定区域并与Cas9复合,Cas9识别目标序列中的PAM并发挥其核酸内切酶的功能使DNA双链断裂。这一过程可以触发两种修复机制:一种是非同源末端连接(NHEJ),将突变引入双链断裂位点;另一种是同源重组修复(HR),将供体DNA信息插入到断裂位点中。

CRISPR/Cas 9 Technology

CRISPR-Cas9系统的亮点:

  • 不引入任何外源性DNA进入目标基因区域(仅限基因敲除项目)
  • 与ZFNs和TALENs相比更加简单高效
  • 可以用于建立基因插入和基因敲除的细胞系
  • 被誉为2013年重大学术突破之一

案例:

应用GenCRISPRTM技术建立敲除谷氨酰胺合成酶(GS)的DG44细胞系
  • 设计合成一条优化的gRNA序列用以定位GS等位基因,将共转Cas9转入DG44 细胞中,并使用测序分析
  • 通过链终止法分析确定包含移码突变的单克隆(图1)
  • GS基因敲除细胞系中检测不到GS蛋白表达 (图2)
  • 为检测功能缺失,在不添加谷氨酰胺的培养基和谷氨酰胺梯度浓度培养基中培养GS敲除细胞(图3)。GS敲除细胞无法在不添加谷氨酰胺的培养基中生长,但可以在谷氨酰胺梯度浓度培养基中生长,由此证明,GS敲除细胞的功能缺失
  • 综上所述,GenCRISPRTM成功的定位敲除了GS基因,使细胞失去GS表达及相关功能。

Deletion on GS allele causes frame shift mutation
Glutamine synthetase is not detected by an anti-GS andtibody in GS knockout cell lysate
L-Glutamine Dependence of DG44(GS-/-)

参考文献:

  • Mali P. et al. Cas 9 as a versatile tool for engineering biology. Nat. Methods. 2013 (10)10:957-963
  • Jinek, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA nuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012 337:816-821
  • Horvath P. and Barrangou R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 2010 327:167-170
  • Wang H. et al. One step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 2013 153(4):910-918

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