SAM文库强效激活转录 ——全基因组获得性功能的筛选

SAM文库可强特异性激活基因组中编码基因的转录,用于在人类细胞中进行功能获得性筛选。 CRISPR/Cas9协同转录激活调节子(SAM)是一种设计的蛋白复合物,能够强效激活内源性基因的转录。失活的Cas9核酸酶通过gRNA靶向于基因组中的特异性位点。SAM复合物包含3个转录激活结构域-VP64,P65和HSF1,可靶向于转录起始位点上游200bp位点,从而起到协同加强下游基因转录的作用。SAM使用失活的Cas9以确保不造成内源基因组的链断裂。人全基因组SAM文库可激活RefSeq数据库 (23,430亚型)中的所有已知的编码亚型,以用于功能获得性的筛选。SAM文库已经被广泛使用于原代的小鼠,人细胞,干细胞,癌细胞及各种稳定细胞系。SAM文库筛选允许客户在不同条件下鉴定任何细胞存活必须的基因,以及那些因为激活使癌细胞产生耐药性的基因。如需了解关于SAM文库设计&构建的完整信息,可查看文献:Konermann S*, Brigham MD*, Trevino AE, Joung J, Abudayyeh OO, Barcena C, Hsu PD, Habib N, Gootenberg JS, Nishimasu H, Nureki O & Zhang F. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature, doi:10.1038/nature14136.

SAM文库内容

SAM文库交付

Cat. No. 文库名称 载体
交付量+
周期*
SC1770-1 Human SAM Library

pLenti sgRNA(MS2)_zeo
pLenti dCas-VP64_Blast
pLenti MS2-P-HSF1_Hygro

1 μg
5-7
SC1770-25
25 μg
5-7
SC1770-100
100 μg
5-7
SC1770-200
200 μg
5-7
SC1754-1 Human SAM Library

pLenti sgRNA(MS2)_puro
pLenti dCas-VP64_Blast
pLenti MS2-P65-HSF1-Hygro

1 μg
5-7
SC1754-25
25 μg
5-7
SC1754-100
100 μg
5-7
SC1754-200
200 μg
5-7
SC1844-1 Mouse SAM Library

pLenti sgRNA(MS2)_puro
pLenti dCas-VP64_Blast
pLenti MS2-P65-HSF1-Hygro

1 μg
5-7
SC1844-25
25 μg
5-7
SC1844-100
100 μg
5-7
SC1844-200
200 μg
5-7

+ 文库以25 μg为单位交付;4 x 25 μg(100 μg 文库)或8 x 25 μg (200 μg 文库);*交付周期为工作日;**需求量可以100 µg为单位向上增加。

如何使用SAM文库,用于功能获得性的筛选

SAM文库是CRISPR gRNA 混合文库,直接靶向基因组每一个转录起始位点的上游。

对于SAM 功能获得性的筛选,人全基因组的SAM sgRNA文库需与另外两个SAM元件结合,即dCas9-VP64 与MS2-P65-HSF1,这三个SAM元件共同转导入细胞中。为适于共转导及筛选,三个慢病毒载体都有各自的抗性标记。三个元件都是以慢病毒载体形式交付,且病毒载体都是经过优化的,能够复制高滴度,以有效转导原代细胞或培养细胞系。SAM 文库以较低的MOI值转导到细胞群中,以保证每个细胞进入不超过1条gRNA。转导完成后在进行文库筛选之前,应对细胞进行NGS深度测序,以评估gRNA在细胞中的表现。筛选完成后,进行第二轮NGS测序并数据分析,用于鉴定筛选过程中丢失或富集的gRNA。为了筛选到SAM文库中的阳性克隆,您需对多个富集gRNA的基因进行鉴定。更多SAM筛选流程,请参考SAM/Genome Engineering网站。

SAM 文库构成

SAM复合物由三部分构成:
  • 核酸酶活性失活的Cas9-VP64融合蛋白
  • sgRNA,其形成的茎环部分包含了两个MS2 RNA适配子
  • MS2-P65-HSF1激活辅助蛋白

三个不同的激活结构域- VP64, P65 and HSF1, 协同激活转录

三个元件都由单独的慢病毒载体编码。 所有三个载体必须共转染进细胞才能使得SAM发挥作用 人全基因组的SAM gRNA文库序列可点击这个.csv文件中获取

SAM文库载体

金斯瑞交付的SAM文库是一个混合文库,包含:sgRNA克隆到gRNA慢病毒表达载体,以及需要共同转导的dCas9-VP64 和 MS2-p65-HSF1慢病毒表达载体。

载体名称 选择标记 载体图谱
lenti sgRNA(MS2)_zeo
Zeo
lenti dCas9-VP64_Blast
Blast
lenti MS2-P65-HSF1_Hygro
Hygro

CRISPR/Cas9 基因组编辑相关服务

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您可发邮件至gene@genscript.com.cn , 金斯瑞可按照张峰实验室提供的SAM文库扩增流程、经过二代测序量化gRNA及库的复杂性,为您提供扩增及经过验证的SAM文库

    CRISPR™产品和服务执照许可
  • 金斯瑞为客户提供的GenCRISPR™产品和服务得到美国 Broad 研究所,哈佛大学和麻省理工学院授权许可。GenCRISPR™产品和服务受到US 8,697,359, US 8,771,945, US 8,795,965, US 8,865,406, US 8,871,445, US 8,889,356, US 8,889,418, US 8,895,308, US 8,906,616及多国同等专利保护。
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