gRNA constructs

CRISPR/Cas9基因组编辑-gRNA质粒构建

CRISPR/Cas9是一种来源于细菌获得性免疫的由RNA指导的Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。只需要在细胞中导入合成的sgRNA或sgRNA表达载体,即可配合同时表达的Cas9核酸酶,对任何物种的基因组进行高效率的定向编辑。相比于ZFN系统和TALEN系统,CRISPR/Cas9是目前操作最便捷,耗时最短且效率足够高的基因组定点编辑技术。

金斯瑞为您提供的CRISPR材料源于张峰实验室研发,所提供的CRISPR产品和服务得到美国 Broad 研究所授权许可,包括:

  • 已设计好的sgRNA序列,可高效特异地靶向人或小鼠基因组的任何基因
  • 根据质粒转染实验所需要的抗生素筛选方法选择适合的all-in-one gRNA-Cas9载体或单一载体(非病毒质粒转染)
  • 改进的慢病毒载体或AAV载体
  • 基于CRISPR激活内源基因转录的SAM质粒

质粒构建选择

  • WT SpCas9- SpCas9是最常用的Cas9核酸酶,来自于酿脓链球菌,编辑高效但存在脱靶效应;
  • SAM- 没有切割活性的Cas9与激活元件协同起作用的复合物,可激活内源性基因的转录;
  • Nickase- SpCas9 D10A突变株,相对于WT SpCas9的双链断裂,nickase产生DNA单链断裂,由一对nickase共同作用,才可完成双链断裂;两个gRNAs同时恰巧靠近脱靶位点的可能性极低,因此提高了gRNA识别的特异性,大大降低了脱靶率;
  • SaCas9- 来自金黄色葡萄球菌的Cas9核酸酶(SaCas9),比SpCas9小25%,使得AAV Cas9包装成为可能。在切割效率和DNA靶向精确度方面,SaCas9 与SpCas9相当。

服务优势

  • 经过验证的质粒结构和优惠的价格:价格实惠,服务涵盖gRNA设计,合成并克隆至任一载体,欢迎询价订购;
  • 即时准备交付:超过20,000个质粒可即时交付(注:需要6个工作日来完成QC检测);
  • gRNA设计更便捷:gRNA序列由张锋实验室设计,涵盖人和小鼠基因组所有基因。由张峰实验室开发的设计发现,现可设计多达12个物种的gRNA。关于gRNA设计:
    • Genome-wide gRNA database: 查找野生型SpCas9 和 SAM的人或小鼠sgRNA序列;
    • gRNA design tool: 查找多物种中用于WT SpCas9或nickase的gRNA序列;
    • Online request form: 专家团队设计特殊的gRNA应用于任何物种的编码或非编码基因.
  • 免费 all-in-one载体,或克隆至任意载体:选择金斯瑞免费载体,包括all-in-one载体等。如果需要克隆到其它载体,请提前告知,我们将免费进行亚克隆,您将收到适用于表达的CRISPR/Cas9载体。
  • GenCRISPR™ gRNA定制化合成和克隆到您想要的载体,仅需10个工作日。

应该选择哪种gRNA

随着CRISPR/Cas9基因组编辑技术的持续火热,对gRNA质粒载体的数量也相应增加。不同CRISPR载体具有不同的优点,取决于您的实验系统和下游的应用。

如何设计gRNA序列? 设计gRNA序列包括四个步骤:(1)确定靶基因的位置;(2)寻找Cas9靶向的适当序列;(3)检测脱靶效应;(4)选择能恰当结合目标位置的gRNA。金斯瑞gRNA数据库和在线设计工具能够提供脱靶评分和染色体位置信息,帮您在选择gRNA序列时,避免许多臆测性的工作。了解更多gRNA序列设计实例信息,请点击此处

选择all-in-one载体还是双载体系统?大多数情况下,无论使用非病毒或慢病毒转染方法,优先选用all-in-one载体系统。优点是只需要转染一次,gRNA和Cas9表达为1:1比例。载体上通常包含选择标记,如抗生素抗性或荧光蛋白标记,能够更方便地选择阳性克隆。Cas9和gRNA在不同载体上分开表达的双载体系统,更适用于靶向多个gRNA。这种情况下,Cas9能够先在细胞系中稳定表达,然后转染多个不同的gRNA载体,形成一个细胞库或gRNA库。

什么情况下需要慢病毒载体或腺相关病毒载体? 基因组编辑的质粒构建方式选择,取决于细胞类型和应用。对于许多易于转染的细胞系,用于一般筛选目的,非病毒载体能够很好的起作用。慢病毒转染通常用于原代细胞培养和难转染的细胞中,具有较低的瞬时转染效率。使用all-in-one载体或双载体系统,取决于是否应用于建立单靶点敲除细胞系或细胞库。腺相关病毒(AAV)载体具有低的免疫原性,更适用于体内基因delivery. 由于AAV载体的装载容量通常比其它载体小,约为4.5 kb,将SpCas9重组进这种载体有一定的困难。SaCas9比SpCas9更小,更适用于AAV包装。

CRISPR相关资源

    CRISPR™产品和服务执照许可
  • 金斯瑞为客户提供的GenCRISPR™产品和服务得到美国 Broad 研究所,哈佛大学和麻省理工学院授权许可。GenCRISPR™产品和服务受到US 8,697,359, US 8,771,945, US 8,795,965, US 8,865,406, US 8,871,445, US 8,889,356, US 8,889,418, US 8,895,308, US 8,906,616及多国同等专利保护。
  • GenCRISPR™产品和该服务中生成的试剂只能作为工具用于科学研发目的,不得用于以下用途:
    (1)任何人体或临床的使用;(2)修改任何人类生殖体系,包括改变人类胚胎或人的生殖细胞的DNA;(3)任何作为兽药或在牲畜体内的使用;(4)制造、批发、进口、出口、运输、销售、许诺销售、市场营销及推广,或其他开发,对人类或动物的测试服务,治疗或诊断。
  • GenCRISPR™服务使用者和产品的购买者:
    不可转让GenCRISPR™产品和该服务中生成的试剂于第三者。GenCRISPR™产品和该服务中生成的试剂只能作为工具用于科学研发目的,不得用于任何商业目的。

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