引物纯化方式建议

金斯瑞拥有20多年经验丰富的引物专家团队及多台国际先进的DNA合成仪,合成的引物纯度高且反应不完全的短链少,应用于PCR扩增、DNA测序以及基因合成等的实验,无需进一步纯化。但未进一步纯化的引物始终含有合成和脱保护不完全的产物、合成不正确的引物以及在合成后处理中从碱基上切割下来的保护基团,因而是否需要进一步纯化取决于对副产物占最终产物大概比例的评估以及这些副产物对客户后续实验的影响程度。

通常而言,引物进一步纯化主要起到三个方面的重要作用:1.从最终产物(n mer)中去除反应不完整的短链引物(n-1 mer, n-2 mer等);2.去除引物合成反应中的副产物;3. 去除从碱基上切割下来的保护基团。 引物纯化方式有很多种,目前常见的几种引物纯化方式,如C18柱脱盐、RPC纯化、ePAGE纯化、PAGE纯化及HPLC纯化等。表1即对以上几种纯化方式进行了一一介绍。

表1. 引物纯化主要方式的介绍

纯化方式
详细说明
C18柱脱盐 又称为简易反相柱,对DNA有特异性吸附,可被有机溶液洗脱,但不会被水洗脱,因此能有效地去除盐分,但不能有效去除比目的片段短的小片段。该方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。
RPC纯化 RPC纯化是通过反相净化滤芯 (Reverse Phase Cartridge) 对引物进行纯化,纯化原理与反相HPLC纯化一样。与反相HPLC比较,RPC是一种有效且更加经济的纯化方式。反相净化滤芯通常包含一种疏水基质如 C18的硅胶,能够很好的吸附DNA,并且可以用水轻松地将切割下来的保护基团和短的引物片段从反相柱上洗掉。RPC纯化的引物可以应用于DNA测序、 PCR及基因合成等。
ePAGE纯化 ePAGE是一种利用快速电泳对引物进行分离纯化的方法, 具有通量大,速度快的特点。依靠全自动进样,快速电泳,自动纯化等设备,短时间内完成DNA条带的分离纯化。纯度可满足大多分子生物学实验需求,如质粒DNA测序、全基因合成、定点突变、PCR克隆等
PAGE纯化 PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对引物DNA进行分离,然后从凝胶中回收目的DNA。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法,纯化后的DNA纯度大于90%,对长链Oligo DNA (大于50 mer)的纯化特别有效。
HPLC纯化 HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理,对引物DNA进行纯化。该方法用于分离纯化或分析时能达到很高的纯度和灵敏度。在引物DNA的分析和纯化中,常用的有离子交换(ion-exchange)HPLC和反相(reverse-phase)HPLC。reverse phase HPLC:纯度大于90%;ion exchange HPLC:纯度大于95%,可以有效的去除N-1短片段。HPLC纯化主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的缺点是成本较高,批量生产效率不高。

金斯瑞采用RPC、ePAGE、 PAGE、HPLC几种纯化方式,在选择上主要根据引物的长度和应用方面对纯度的要求而定,表2即从引物长度的角度总结了以上每一种纯化方法的适用范围。您可根据实验需要,选择合适的引物纯化方式。如您需要进一步的指导,请联系金斯瑞技术支持。

表2. 引物纯化主要方式的适用范围及建议

纯化方式
引物长度
建议
适用范围
<15 mer
15~40 mer
41~59 mer
60~120 mer
RPC
适用*
推荐
适用
不适用
快速、通量大,常用于PCR、测序引物等。 常用于PCR扩增、全基因合成及DNA测序等。
ePAGE
不适用
推荐
适用
不适用
纯度可满足大多分子生物学实验需求。 常用于质粒DNA测序、全基因合成、定点突变 (环状突变) 及 PCR克隆等。
PAGE
不适用
适用
适用
推荐
常规分子生物学实验引物采用RPC纯化或ePAGE纯化即可;但强烈建议长链引物(≥60 mer)选用PAGE纯化。 50 mer以上的未修饰寡核苷酸,用于定点突变、克隆、蛋白结合凝胶迁移电泳分析、治疗与诊断用途。
HPLC 离子交换
推荐
适用
适用
不适用
对纯化短链引物(<15 mer)特别有效,但此法纯化通量小、成本较高。如实验对纯度要求非常高,建议选用HPLC与PAGE双重精制。 ● 小于50 mer的未修饰寡核苷酸,用于定点突变、克隆、蛋白结合凝胶迁移电泳分析、治疗用途;
● 带有疏水基团的修饰引物;
● 商业化的诊断引物或探针(80%~95%纯度)。
反相
适用
不适用
不适用

*为了保证您的引物纯度,对于<5mer的短链引物选择RPC纯化前请先致电咨询


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