磷酸化引物

NgAgo-gDNA

NgAgo是Natronobacterium gregoryi Argonaute这一短语的简称。韩春雨老师团队就是利用格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)的Argonaute实现了DNA引导的基因组编辑,并发现NgAgo作为一种DNA介导的核酸内切酶,适合在人体细胞中进行基因组编辑。NgAgo结合24个碱基长度的5'磷酸化单链DNA(5p-ssDNA),并由这段guide-DNA介导,切割具有相同/互补序列的双链DNA。

金斯瑞磷酸化引物特点

金斯瑞生物科技拥有强大的引物合成平台,经验丰富的引物专家团队,能够合成不同序列、不同长度、不同浓度的磷酸化引物;同时,提供多种结构修饰,其中包括LNA,硫代,甲基化等的合成服务,使gDNA稳定性更高,gDNA结构更加灵活。

  • 质量保证:严格执行ISO 9001:2008质量管理体系,保证产品质量
  • 快速交付:PAGE纯化和HPLC纯化可快至仅需2天
  • 服务周到:完善的引物合成在线订购系统和售后服务

NgAgo-gDNA系统特点

  • 该系统的guide DNA是24个碱基,5'磷酸化的ssDNA
  • 没有PAM序列限制,能够识别特定位点,并切断DNA双链,包括高GC位点
  • NgAgo会直接将gDNA配对区的靶DNA移除1-20个bp
  • 对错配的容忍度很低,增加了特异性高,ssDNA与靶位点单碱基错配会大大降低切割效率,连续3个错配基本导致该系统失效
  • gDNA与NgAgo的结合在NgAgo蛋白表达后的很短时间内进行
  • NgAgo一旦与gDNA结合就不能体内环境下(37度)更换其他gDNA
  • 切割效率与CRISPR/Cas9系统相当

NgAgo-gDNA的优势

    特点
    NgAgo-gDNA
    CRISPR(Cas9-gRNA)
    共同点
    绑定并特异性切割靶向DNA双链
    错配容忍度
    1个碱基错配可使活性降低70%-100%,三个错配碱基将完全无活性
    至多可容纳5个错配碱基
    切割基因组位置
    可切割基因组任何位置,没有PAM序列限制,不受GC序列影响
    受PAM序列限制,高GC含量位点剪切活性低
    切割方式
    NgAgo切除靶位点1-20bp
    Cas9只切一刀
    特异性
    低脱靶,24个碱基的gDNA,细胞内几乎没有5p-ssDNA片段
    细胞内有大量非特异性RNA片段,增加误导Cas9的可能
    guide 链
    长短约为24个碱基。引导链为单链DNA,合成较为简便高效,稳定性高
    长度约为36个碱基和67个碱基。为双链RNA(可设计拼接成单链RNA),合成难度相对高且低效,稳定性差。tracrRNA 在其3'末端还需形成特异的发卡结构,需要额外的退火实验
    蛋白
    NgAgo(887 AA)蛋白小,Argonaute家族庞大,备选甚多
    Cas9(1368 AA)蛋白大,备选较少

NgAgo-gDNA的优化和修饰建议

  • gDNA浓度对切割活性的影响:不同浓度的5p-ssDNA进行实验,检测切割活性
  • gDNA与靶点DNA的结合稳定性:24个碱基的5p-ssDNA中加入LNA可提高与DNA链结合的稳定
  • gDNA进入细胞内的效率:硫代可有助于5p-ssDNA通过细胞膜进入细胞内部,同时,硫代也可以增加5p-ssDNA的稳定性、增强与NgAgo蛋白的结合
  • 甲基化研究:在24个碱基的5p-ssDNA的核苷酸上进行甲基化修饰,如5-甲基胞嘧啶和N6-甲基腺嘌呤,考察甲基化与未甲基化gDNA与靶点结合的差异
  • gDNA序列长度的影响:随机移除或增加若干核苷酸形成不同长度的gDNA,进行重复性验证

参考文献

  • 1. Gao, F.; Shen, X.Z.; Jiang F.; Wu, Y.; Han, C. DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute. Nature Biotechnology. 1-6 (2016)
  • 2. Braasch D.A.; Corey D. R. Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA. Chemistry & Biology 8, 1-7 (2001).
  • 3. Corey D. R. et al. RNA Interference in Mammalian Cells by Chemically-Modified RNA. Biochemistry 42, 7967-7975 (2003).

金斯瑞5'磷酸化引物——品质保证

3个金斯瑞5'磷酸化引物经HPLC检测、MASS检测、PAGE检测,结果如下:

    样品名称
    引物序列
    理论分子量
    5'磷酸引物 1
    5'-p-GTGGTCGGGGTAGCGGCTGAAGCA-3'
    7594.9
    5'磷酸引物 2
    5'-p-CAAGCAGCACTCTGCCCTCGTGGG-3'
    7394.75
    5'磷酸引物 3
    5'-p-CCCACGAGGGCAGAGTGCTGCTTG-3'
    7474.81
    结果说明
    产品引物纯度高,且未见5'磷酸脱落,若有5'磷酸基团脱落,则在MS分析报告上会出现[M-78]的峰


金斯瑞还拥有更多种类的修饰/标记引物及水解探针等标记引物,日产修饰引物上千条,100%保证引物质量

修饰/标记引物

    修饰类型
    修饰标记*
    纯化方式
    磷酸基团
    5' PO4, 3' PO4
    PAGE/HPLC
    LNA合成
    LNA,LNA-DNA,LNA-RNA
    PAGE/HPLC
    稀有碱基
    dI,dU
    PAGE
    硫代修饰
    Phosphorothioate
    PAGE/HPLC
    甲基化修饰
    5-Methyl dC,N6-Methyl dA
    HPLC
    巯基/氨基修饰
    5' or 3' SH C6;5' NH2 C6, 3' NH2 C7
    HPLC
    Spacers
    Spacer C3/C6,Spacer 9/18,dSpacer
    PAGE/HPLC
    生物素/地高辛
    5' or 3' Biotin,5' Biotin TEG,Dual/dT/PC Biotin;5' or 3' Digoxin
    HPLC
    荧光标记
    Cy3,Cy5,FAM,TET,6-JOE,Rox,TAMRA
    HPLC

双/多重荧光探针

    分类
    标记形式
    纯化方式
    TAMRA
    5' FAM-3' TAMRA,5' HEX-3' TAMRA, 5' TET-3' TAMRA,
    5' JOE-3' TAMRA
    Dual HPLC
    DABCYL
    5' FAM-3' DABCYL,5' HEX-3' DABCYL,5' TET-3' DABCYL,
    5' JOE-3' DABCYL,5' TAMRA-3' DABCYL,5' Cy5-3' DABCYL
    HPLC
    BHQ1
    5' FAM-3' BHQ1,5' HEX-3' BHQ1,5' JOE-3' BHQ1
    HPLC
    BHQ2
    5' ROX-3' BHQ2
    HPLC

PAGE引物——100% 保证质量

金斯瑞的PAGE纯化引物与某同行公司的PAGE纯化引物比较

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