PCR克隆及亚克隆FAQ

Q1:如需做克隆及亚克隆,我需要提供什么模板?如提供PCR产物,该如何处理?

A1:通常您需提供的模板是含有目的基因的质粒或菌液,最好插入片段已经过测序验证。如提供PCR产物,由于PCR产物容易降解,我们建议您先做TA克隆,将PCR产物装在T载体上,再进行测序验证,以含有目的基因的T载体作为亚克隆模板,这样成功率较高。

Q2:做亚克隆服务需提供哪些材料和信息?

A2:需提供以下材料和信息:

  • 目的基因序列,如果该目的基因经过测序,需要您提供测序彩图文件(abi格式);
  • 含有目的基因的模板质粒或菌液,以及模板质粒的大小、抗性、图谱等相关信息;
  • 目标载体及相关信息:如果目标载体为商业化空白载体,需要提供载体全称;如果目标载体经过改造,需要提供载体全序列;
  • 亚克隆方式:即利用哪两个酶切位点将目的基因亚克隆至目标载体。

Q3:金斯瑞交付哪些结果?提供给我的数据报告包括哪些内容?

A3:交付结果包括:

  • 实物发货:1管约4 μg的质粒冻干粉,1管穿刺菌;
  • 数据报告:测序结果、测序结果和目的序列的比对文件、QC报告、质粒结构图。如果您需要提供甘油菌,需要在安排订单时注明。

Q4:哪些类型载体的亚克隆难度比较大?

A4:载体比较大、低拷贝载体、背景不明确的载体、自杀性载体和抗性特殊的载体,亚克隆难度比较大。例如:pCAMBIA-1301、pBI121、pKSV7、pMG36e(红霉素抗性)和pCYT(氯霉素抗性)等。

Q5:什么叫甲基化现象?

A5:甲基化现象是一种表观遗传修饰,它是由DNA甲基转移酶催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体,将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶的一种反应,在真核生物DNA中,5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基,CG二核苷酸是最主要的甲基化位点。一般说来,DNA的甲基化会抑制基因的表达,DNA的甲基化对维持染色体的结构、X染色体的失活、基因印记和肿瘤的发生发展都起重要的作用。

Q6:什么叫移码现象?在设计亚克隆方案时如何避免移码?

A6:移码现象是由于基因中增加或减少1~2个碱基(改变的碱基数不是3或3的倍数)使该位点后面的DNA序列发生移码,结果导致不能顺利表达出目的蛋白。我们在设计亚克隆方案时应注意:a.酶切位点的选择,如NcoI(CCATGG),由于其中有一个起始密码子,很容易产生移码,所以,在使用这类酶切位点时应谨慎,应添加移码保护碱基;b.尽量利用载体上已有的序列。