测序常见问题解答

1.为什么提供新鲜的菌液?如何提供新鲜的菌液?
2. DNA测序样品用什么溶液溶解比较好
3. 提供DNA测序样品时,提供何种形态的比较好
4. 提供的测序样品为菌体时,以什么形态提供为好
5. PCR产物直接测序有什么要求?
6. 为什么PCR产物直接测序必须进行Agarose胶纯化?
7. 如何进行PCR产物纯化?
8. 对于测序用的质粒DNA的要求有哪些
9. 如何鉴定质粒DNA浓度和纯度?
10. 对测序引物的要求有哪些?
11. 为什么测序引物必须特异地与DNA模板结合?
12. 测序结果有很多套峰,还照常收费,为什么
13. 为什么用PCR产物测序时,经常会出现套峰现象
14. 出现套峰的原因是什么?
15. 测序结果不到800 Bases,还照常收费了,为什么
16. 为什么在测序报告上找不到引物序列?
17. 在测序结果上,找不到测序用引物后面的序列,为什么
18. PCR片段直接测序和PCR片段经克隆后测序的结果有何区别
19. 测序结果和文献资料不一样,为什么
20. 我的基因序列与标准序列为什么有差别?
21. DNA片段很长,一个反应读不到头,怎么办
22. 测序完成后,测序样品和引物将如何处理(或保存)
23 怎样选择(设计)测序用引物
24. 觉得你给我的结果完全不是我需要的序列?
25. 我的样品上有一个杂合位点,为什么在你们的报告上看不到杂合的信号?
26. 超过6Kb的DNA片断如何进行测序?
27. 全自动荧光测序的准确性如何?
28. 用测序的方法检测点突变可靠吗?
29. 我要求5'到3'正向测序,为什么你们给我的序列是反的?
30. 我的样品在你们所说的可靠范围内有一处存在疑问,能否重新测一次?
31. 我的样品你们已经测通了,但为什么在overlap区有这么多的错配,给出的全序列和单个报告也存在差异,我该相信谁?
32. 你们为什么在primer walking时总将引物设计的那么靠前?
33. 我有一个4KB的PCR片段,希望你们帮我测通。
34. 样品送测序前已经鉴定过了,有插入片段的,为什么测序结果是一个空质粒?
35. 对于测序结果有疑问怎么办
 
Q-1.为什么提供新鲜的菌液?如何提供新鲜的菌液? 返回顶端
A-1.首先,新鲜的菌液易于培养,可以获得更多的DNA,同时足够限度地保证菌种的纯度。如果您提供新鲜菌液,用封口膜封口以免泄露;也可以将培养好的4~5ml菌液沉淀下来,倒去上清液以方便邮寄。同时邮寄时尽量用盒子以免邮寄过程中压破。
 
Q-2.DNA测序样品用什么溶液溶解比较好? 返回顶端
A-2.溶解DNA测序样品时,用灭菌蒸馏水溶解较好。DNA的测序反应也是Taq酶的聚合反应,需要一个很好的酶反应条件。如果DNA用缓冲液溶解后,在进行测序反应时,DNA溶液中的缓冲液组份会影响测序反应的体系条件,造成Taq酶的聚合性能下降。
  有很多客户在溶解DNA测序样品时使用TE Buffer。的确,TE Buffer能增加DNA样品保存期间的稳定性,并且TE Buffer对DNA测序反应的影响也较小,但根据我们的经验,我们还是推荐使用灭菌蒸馏水来溶解DNA测序样品。
 
Q-3.提供DNA测序样品时,提供何种形态的比较好? 返回顶端
A-3.我们推荐客户提供菌体,由我们来提取质粒,这样DNA样品比较稳定。 如果您可以提供DNA样品,我们也很欢迎,但一定要注意样品纯度和数量。如果提供的DNA量不够,我们就需要对质粒进行转化,此时需收取转化费。有些质粒提取法提取的DNA质量很好,象TaKaRa、Qiagen、Promega的质粒制备试剂盒等。
  提供的测序样品为PCR产物时,特别需要注意DNA的纯度和数量。PCR产物必须进行切胶回收,否则无法得到良好的测序效果。
  有关DNA测序样品的详细情况请严格参照"测序样品的提供"部分的说明。
 
Q-4.提供的测序样品为菌体时,以什么形态提供为好? 返回顶端
A-4.一般,菌体的形态有:平板培养菌、穿刺培养菌,甘油保存菌或新鲜菌液等。我们提倡寄送穿刺培养菌或新鲜菌液。
  平板培养菌运送特别不方便,我们收到的一些平板培养菌的培养皿在运送过程中常常已经破碎,面目全非,需要用户重新寄样。这样既误时间,又浪费客户的样品。一旦是客户非常重要的样品时,其后果更不可设想。而甘油保存菌则容易污染。
  制作穿刺菌时,可在1.5 ml的Tube管中加入琼脂培养基,把菌体用牙签穿刺于琼脂培养基(固体)中,37℃培养一个晚上后便可使用。穿刺培养菌在4℃下可保存数个月,并且不容易污染,便于运送。
 
Q-5.PCR产物直接测序有什么要求? 返回顶端
A-5.(1) 扩增产物必须特异性扩增,条带单一。如果扩增产物中存在非特异性扩增产物,一般难以得到好的测序结果。
  (2) 必须进行胶回收纯化。
  (3) DNA纯化在1.6~2.0之间,浓度50ng/µl以上。
 
Q-6.为什么PCR产物直接测序必须进行Agarose胶纯化? 返回顶端
A-6.如果不进行胶纯化而直接用试剂盒回收,经常会导致测序出现双峰甚至乱峰。这主要是非特异性扩增产物或者原来的PCR产物去除不干净导致。大多数所谓的PCR"纯化试剂盒"实际上只是回收产物而不能起到纯化的作用。对于非特异扩增产物产物肯定是无法去除,而且通常它们不能够完全去除所有的PCR引物,这会造成残留的引物在测序反应过程中参与反应而导致乱峰。
 
Q-7.如何进行PCR产物纯化? 返回顶端
A-7.PCR产物首先必须用Agarose胶电泳,将目的条带切割下,然后纯化。使用凝胶回收试剂盒回收。产物用ddH2O溶解。
 
Q-8.对于测序用的质粒DNA的要求有哪些? 返回顶端
A-8. 对于测序用质粒DNA的一般要求:
  (1) DNA纯度高,1.6~2.0之间,不能有混合模板,也不能含有RNA,染色体DNA,蛋白质等。
  (2) 溶于ddH2O中,溶液不能含杂质,如盐类或EDTA等螯合剂,否则将干扰测序反应的正常进行。
 
Q-9.如何鉴定质粒DNA浓度和纯度? 返回顶端
A-9.我们使用水平琼脂糖凝胶电泳,并在胶中加入0.5ug/ml的EB,加入一个已知浓度的标准样品。电泳结束后在紫外灯下比较亮度,判断浓度和纯度。此方法可以更直接、准确地判断样品中是否含有染色体DNA、RNA等,也可以鉴别抽提的质粒DNA的不同构型。
  质粒DNA的3种构型是指在抽提质粒DNA过程中,由于各种原因的影响,使得超螺旋的共价闭合环状的质粒(SC)的一条链断裂,变成开环状(OC)分子,如果两条链发生断裂,就变成线状(L)。这3种分子有不同的迁移率,通常,超螺旋(SC)迁移速度最快,其次是线状(L)分子,最慢为开环状(OC)分子。使用紫外分光光度计检测,或者用EB-标准浓度DNA比较法只能检测抽提到的产物中的浓度,甚至由于抽提的质粒DNA中含有RNA、蛋白质、染色体DNA等因素的干扰,浓度检测的数值也是没有多少意义的。
 
Q-10.对测序引物的要求有哪些? 返回顶端
A-10.对测序引物的一般要求:
  (1) 特异性与测序模板结合,不能有多于4个碱基以上的错配现象
  (2) 不能含有混合碱基
  (3) 长度17~25碱基
  (4) 纯度高,推荐PAGE纯化
  (5) 用ddH2O溶解,不要用TE缓冲液溶解。
 
Q-11.为什么测序引物必须特异地与DNA模板结合? 返回顶端
A-11.测序引物与待测样品DNA分子只能有一个结合位点是测序成功的关键。如果测序引物在DNA模板分子上有不只一个的结合位点,将造成测序反应过程中引物链在几个结合位点处同时扩增,反映在测序峰图上将出现双峰或乱峰,无法读取序列。
 
Q-12.测序结果有很多套峰,还照常收费,为什么? 返回顶端
A-12.DNA模板上出现二处以上的引物结合位点,或者DNA模板上有严重的重复序列,以及测序引物不纯时, 测序结果便会出现套峰现象(见图4)。出现这种现象的原因由DNA模板本身或者引物本身所造成,对这些结果(公司保证进行2次以上的测序工作),公司会根据具体情况进行收费(详细见测序结果说明)。
 
Q-13.为什么用PCR产物测序时,经常会出现套峰现象? 返回顶端
A-13.PCR产物测序出现套峰现象,一般有以下几种原因:
  (1) PCR用模板不纯或PCR用引物特异性不好,扩增出的产物除了目的片段外,还有与目的片段长度相近的片段,即使用凝胶电泳也无法分离开,这样的PCR产物测序结果是套峰。
  (2) 结构上的原因,造成了PCR产物测序出现套峰的现象。PolyA/G/C/T以及原因不明的复杂结构的存在,都会出现测序结果套峰的情况。
 
Q-14.出现套峰的原因是什么? 返回顶端
A-14.在测序反应中,模板或引物的原因都可能造成套峰的形成,归结其形成原因有以下几点
  (1) 测序引物在模板上有两个结合位点形成套峰
  (2) 模板不纯,如果是质粒或是菌液,原因是非单克隆,如果是PCR,原因为非特异性条带
  (3) 模板序列的特殊结构,如poly结构、发卡结构等
  (4) 引物降解,引物不纯,或引物的特异性不好
 
Q-15.测序结果不到800 Bases,还照常收费了,为什么? 返回顶端
A-15.如在DNA样品中的DNA序列分布匀称,没有复杂结构时,正常的测序反应能保证达到800 Bases以上。但有一些DNA样品立体结构复杂,造成聚合酶延伸反应终止,测序信号突然减弱或消失,或者测序结果出现套峰现象。出现这些现象的原因由DNA模板本身所造成(公司保证进行2次以上的测序工作)。 对这些结果,公司会根据具体测序情况,进行收费(详细见测序结果说明)。出现这些情况的原因分析如下:
  (1) G/C rich、G/C Cluster:这种情况一般表现为测序信号突然减弱或消失(见图1);
  (2) A、T的连续结构:这种情况一般表现为A、T连续结构后面的测序结果出现套峰(见图2)。根据文献记载,原因在于聚合酶进行聚合反应时,由于A或T的连续,聚合酶难以识别完整的每个A或T,在某个A或T的后面便开始进行A或T连续结构以后序列的聚合反应(打滑现象),造成测序结果紊乱,出现套峰。出现这样的情况,建议反向测序。
  一般在多少个A或T的后面能出现这种情况呢? 现在还没有这方面的报道。根据我们的经验,这一情况的出现和A或T的连续结构后面的序列的排列情况有着直接的关系。有时10多个A或T的连续结构后面便出现套峰,但有时60~70个A或T的连续结构后面的序列也一样可以完整地读出来。具体情况还有待考证。
  一般来说,PCR片段直接测序时,A或T的连续结构后面的序列测序结果都会出现套峰。原因在于测序时经历了PCR反应及测序反应(测序反应本身也是PCR反应)二次聚合酶的打滑现象。
  (3) 原因不明的复杂结构,测序结果出现突然信号减弱或消失。从序列上看,DNA碱基排列并无特别异常。估计是DNA整体出现复杂结构,从某一位置开始聚合酶的聚合反应便无法进行(见图3)。
图1 G的连续结构后的测序结果 查看大图
图2 T的连续结构后的测序结果 查看大图
图3 原因不明的测序信号消失 查看大图
图4 同一模板上有两处引物结合位点或DNA结构上有重复序列的测序结果 查看大图
 
Q-16.为什么在测序报告上找不到引物序列? 返回顶端
A-16.这里分四种情况:
  (1) 的确找不到测序使用的引物序列。目前使用的测序方法是在ddNTP上做荧光标记,测序仪通过检测ddNTP上的荧光来读取序列,因为引物本身是不做荧光标记的,所测序列是从引物3' 末端后第一个碱基开始的,所以在测序结果上找不到测序引物的序列。如果是PCR产物,要想得到PCR引物的序列,可以将PCR产物进行双链测通或者将PCR产物克隆到载体上,用载体上的引物(注意此引物也不能离插入片段太近)测序
  (2) 找不到克隆片段的扩增引物。原因可能是您在构建质粒时采用的工具酶的酶切位点距离您的测序引物太近,由于荧光染料的干扰在序列开始的部分不会十分准确
  (3) 还有一种可能是您的插入片段的插入方向是反的,这时您不妨找一下您引物的互补序列
  (4) 存在单引物扩增,有一条引物的特异性不好,有多个结合位点导致只有一条引物参与扩增
 
Q-17.在测序结果上,找不到测序用引物后面的序列,为什么? 返回顶端
A-17.由于测序仪自身缺陷,紧接引物之后的测序结果信号较弱,一般在测序用引物后面几个至数十个(严重时40~50个)碱基会读不出来(或者读错),请引起注意。
 
Q-18.PCR片段直接测序和PCR片段经克隆后测序的结果有何区别? 返回顶端
A-18.众所周知,PCR扩增过程中会出现很多错配现象,但不可能所有的错配都发生在同一位置。PCR片段直接测序时,其结果是PCR片段众多分子的混合物的结果。如果在某一个点上出现了几十次错配现象,但大多数分子(或许是几十万个分子)在这个点上应该还是正确的,在测序时,错配现象也就反映不出来了。因此,PCR片段直接测序的结果反映的是PCR用模板最原始的结果。而PCR片段经克隆后测序是测定了某一个分子的DNA序列。在几十个循环的PCR扩增过程中,很难保证某一个分子的任何点都不发生错配。因此,PCR片段经克隆后的测序结果,往往存在着一些错配的序列,和PCR片段直接测序的结果相比有些碱基会有所不同。这种错配现象的多少取决于PCR扩增时使用的DNA聚合酶的保真性能。要减少PCR扩增过程中的错配现象,在PCR反应时,请选用保真性能高的DNA聚合酶。
 
Q-19.测序结果和文献资料不一样,为什么? 返回顶端
A-19.原因有很多,如同一种动物,在不同的种族之间,或者不同的个体之间,基因序列也不一定完全一样。如果是PCR产物克隆测序, 那还有PCR过程中的错配因素等等。我们提供的测序结果是客户样品序列的忠实结果,不能保证和文献序列完全一致,请理解。
 
Q-20.我的基因序列与标准序列为什么有差别? 返回顶端
A-20.一段基因序列经扩增后,克隆到载体中进行测序。在两个层次上可能导致序列发生变化。首先,在PCR扩增过程中就可能产生错误,将片段克隆到载体中也有可能发生突变;其次,测序的准确率问题。 ABI公司承诺其仪器的测序精度在一定范围内可以达到98.5%以上。由于仪器准确率的限制,在一个较长的序列中发生碱基序列错误是难以避免的。在确认克隆无误的情况下,通过双向测序可以大大减少测序的错误。您如果想得到您的最准确的序列,进行双向测序是很有必要的。只进行简单的单向测序,我们无法保证所测序列的完全准确性,这是由仪器的精度决定的。
 
Q-21.DNA片段很长,一个反应读不到头,怎么办? 返回顶端
A-21.如果DNA片段在载体上,可以用载体上两端的引物同时测序,让其中间交叉互补,便可完全测通。如果这样还读不通,可根据已经测出的序列设计测序引物作进一步测序(此称为Primer Walking法),便可完全测通。
 
Q-22.测序完成后,测序样品和引物将如何处理(或保存)? 返回顶端
A-22.客户需要将测序样品或引物(客户自带的)返还时,我们在发送测序报告的同时,按客户要求寄回样品或引物(客户自带的)。
  2)对于没返回的测序样品和引物,公司负责保存二个月(从样品收到之日算起),超过二个月还需测序的样品,请客户另行提供。
 
Q-23.怎样选择(设计)测序用引物? 返回顶端
A-23.测序用引物要求非常严格,不同于PCR用引物。PCR用引物一般只要能和模板结合,3' 端的几个碱基能完全配对,即使引物长达80~100多个碱基,只要调整PCR反应条件,也能成功进行PCR反应。
  而测序用引物便不一样了,必须严格符合以下要求。本公司的测序用引物全用引物设计软件Oligo设计。在本公司测序时,我们可免费帮助设计测序用引物。。
  ●长度在15~25个碱基左右,一般选择20个碱基(根据GC含量作 适当调整),3' 端尽量选择G或C碱基 (但不绝对),以增加与模板的结合能力。
  ●Tm温度应选择50℃~70℃左右。
  ●GC含量应选择在50%左右,尽量避开A、T、G、C的连续结构。
  ●避开引物自身形成发夹结构或引物二聚体结构等复杂结构。
  ●保证引物和模板100%匹配,特别是3'端的几个碱基一定要100%匹配。同时必须严格保证引物和模板之间只能有一个结合位点。
 
Q-24.觉得你给我的结果完全不是我需要的序列? 返回顶端
A-24.出现这样的情况只有两种可能:
  (1) 我们给您的测序结果对应的不是您的样品
  (2) 您的样品插入部分与您预期的不一致。作为提供测序服务的一方,我们无法判断测得的序列是否与您预期的结果一致,我们可以为您做的是,检查发送给您的测序结果与您提供来的样品是否一致。出现您这样的问题,我们常规的做法是进行验证实验。验证实验的方法是取您的原始菌液重新抽提质粒进行测序。验证实验如在可靠范围内结果与前次不同则说明我们前次的测序结果是有问题的,前次测序的费用免除;如结果仍然相同,那么说明前次测序的结果准确,则您还需要支付这一次测序的费用。
 
Q-25.我的样品上有一个杂合位点,为什么在你们的报告上看不到杂合的信号? 返回顶端
A-25.在检查报告时,设备和我们的技术员都倾向于提供给客户一个单一的信号,所以在出现杂合的位置上给出的信号往往是比较强的一个信号。所以如果您的PCR样品上是存在杂合位点的,请在测序订单上注明,我们在修改报告时会加以注意。但如果在您预期出现杂合信号的位置上只有单一的信号,那么我们是不会人为将其修改为杂合位点的。出现这样的情况可能是在您的样品中杂合成份太少的信号强度不足以被检查到,也许有其他更加灵敏的检测手段可以满足您的要求。
 
Q-26.超过6Kb的DNA片断如何进行测序? 返回顶端
A-26.超过6Kb的DNA片断用Shot Gun 进行测序准确并且节省时间, Shot Gun方法如下:
  (1) 用物理方法打碎DNA
  (2) 回收1~1.5K的片断
  (3) 用核酸酶切平端,连接入载体
  (4) 按照一定比例进行测序,保证每一个区段有3倍以上的数据
  (5) 编辑所有测序数据
  (6) 如果有缺少数据的区域,还需要补充测序,拼接成完整序列
 
Q-27.全自动荧光测序的准确性如何? 返回顶端
A-27.ABI3730测序仪是采用AB公司配套的Big DYE Terminator cycle sequencing Kit,其准确性达到800碱基只有1个以下的错误,并且该测序仪对碱基的判读有一个自身的评判值(Quality Value),根据QV值的大小,也可以帮助我们来判断每一个碱基的准确程度
 
Q-28.用测序的方法检测点突变可靠吗? 返回顶端
A-28.有的客户想用测序的方法检测点突变体,我认为该方法可靠性不高。主要有以下两个原因。首先,我们并不清楚突变的序列与正常的序列的比例是多少。测序反应的信号强度直接与模板的量有关,如果突变的模板所占的比例很少,将直接作为背景噪音了,很难检测出来。只有当测序反应体系中正常的和突变的模板量比较接近时,才能较可靠地检测到突变体的存在。其次,在同一位置,不同碱基的信号强度一般是不一样的。这样即使突变的模板所占的比较较高时,也不一定能准确检测到突变的存在。
  另外,测序仪是设计用来测序正常的碱基序列的,软件在对扫描的结果进行处理时,会尽量提高主峰而将背景信号尽量压低,以得到尽可能好的结果。因此,当某处出现双峰时,测序仪一般会认为信号弱的峰为背景信号,在处理过程中,将弱的峰进一步压低,这样不利于突变体的检测。因此认为,用测序的方法检测突变体的存在不是一个好的方法。
 
Q-29.我要求5' 到3' 正向测序,为什么你们给我的序列是反的? 返回顶端
A-29.您指的可能是插入片段的方向,而我们并不清楚您的样品是如何构建的。我们只能根据质粒上的序列来确定测序方向,所以在测序引物一栏中请不要使用3' 引物和5' 引物这样的字样,因为我们手中的资料在注明方向时可能和您手中的资料方向相反,请以T7,T3,SP6,M13f,M13r这样的形式来填写,或注明酶切位点方向比如"测序方向EcoRI到HindIII"。我们手中等质粒资料有限,有时还需要您提供质粒的相关资料。
 
Q-30.我的样品在你们所说的可靠范围内有一处存在疑问,能否重新测一次? 返回顶端
A-30.我们希望您能够告诉我们存在疑问的位点的位置,如果从测序报告上的确无法作出准确判读,我们会重新进行实验。如果您指出的位点信号清晰准确,您仍然要求再进行一次实验,那么实验结果和验证实验是相同的。
 
Q-31.我的样品你们已经测通了,但为什么在overlap区有这么多的错配,给出的全序列和单个报告也存在
差异,我该相信谁? 返回顶端
A-31.给出的全序列是一个拼接的结果,当互相拼接的两个序列存在差异时,应该以序列质量更好的应该为主,这也就是为什么会出现错配和全序列与单个测序结果的差异。
 
Q-32.你们为什么在primer walking时总将引物设计的那么靠前? 返回顶端
A-32.我们在设计引物时有两个准则。一是设计引物区域的序列必须准确,二是在引物区后必须还有足够的准确序列以便拼接。这样我们设计引物的位置就必然比较靠前,在满足软件设定的条件下,我们总会选取最靠近3'端的引物来作为最终的测序引物。
 
Q-33.我有一个4KB的PCR片段,希望你们帮我测通。 返回顶端
A-33.大于2KB的PCR片段要测通尽量构建好克隆后再进行测序。这样模板更加稳定,测序效果也更加好一些。
 
Q-34.样品送测序前已经鉴定过了,有插入片段的,为什么测序结果是一个空质粒? 返回顶端
A-34.测序是对样品的最好验证。结果为空载,可能如下:
  (1) 可能在培养过程中发生插入片段的丢失,这种情况的发生无法事先预期
  (2) 提供的克隆是假阳性克隆
 
Q-35.对于测序结果有疑问怎么办? 返回顶端
A-35.请客户仔细阅读"测序结果说明"和"问答"的内容,如果还有疑问,请您在收到测序结果一个月之内与我们联系,我们会及时、认真给您检查测序结果,分析原因。
 

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