测序常见峰图及原因说明

1.PCR产物电泳检测条带单一,为什么测序结果说模板杂?
2. 什么是碱基缺失?
3. 什么是引物不纯?
4. 重复结构对测序有哪些影响?
5. 什么是模板不单一?
6. Poly结构的测序结果是怎样的?
7. 含有回文结构的模板测序结果是怎样的?
8. 测序峰图为前双峰的结果是什么样的?
9. 测序峰图为后双峰是什么样的?
10. 无信号的结果:信号值(ATGC的平均值)皆小于100
11. 飘峰:这是由于用3.0特殊试剂盒时碱基产生替代而出现碱基位移
12. 没有任何干扰的结果
 
Q-1.PCR产物电泳检测条带单一,为什么测序结果说模板杂? 返回顶端
A-1.PCR产物电泳检测的结果只是一个粗略的定性结果。对于与目的片段条带大小只相差几个碱基的非特异性PCR扩增产物是无法用肉眼区分开的。但是DNA测序反应敏感而客观,可以直接反应出模板本身的情况。需要强调的是,高质量的PCR产物才可能得到高质量的测序结果,如果您对PCR产物的纯度不很确定,希望您可以将PCR产物进行克隆处理,以确保得到好的测序结果。以下图为例:该反应的背景信号较高,不利于碱基的判读。
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解决办法:改变PCR条件,重新扩增。或者可以将该PCR产物克隆到质粒中,初步筛选后进行单克隆测序。
 
Q-2.什么是碱基缺失? 返回顶端
A-2.以下图为例:
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碱基缺失常见在PCR产物中,特别是从基因组中扩增得到的PCR片段,上图的186位缺失两个连续的T
解决方法:
   (1) 使用反向引物继续测序,以矫正缺失位点并达到测通的目的。或者将该PCR产物克隆到质粒中,挑取单克隆测序。
   (2) 如果可以确定该PCR片段中不应该有缺失的位点,那么可以改变PCR反应条件,重新扩增。
 
Q-3.什么是引物不纯? 返回顶端
A-3.以下图为例:
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引物不纯造成移码现象,该种现象与模板杂在峰图都表现为背景峰较杂,但是引物不纯在峰图上表现的更有规律,一般在每一个主峰前或者后都有一个同一碱基的小峰。
解决办法:重新合成引物,或者将引物进行PAGE纯化后再进行测序。
 
Q-4.重复结构对测序有哪些影响? 返回顶端
A-4.以下图为例:
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重复结构将导致测序复制框的滑移,重复结构之后峰型混乱。
解决办法:使用反向引物对模板进行测序,测到该重复结构处,即可完成模板全长的拼接。
 
Q-5.什么是模板不单一? 返回顶端
A-5.以下图为例:
(1) 菌液为非单克隆:
  下图是pGEM-T载体测序的结果,在83位点处测序结果出现双峰(插入后双峰),即模板中含有两个或两个以上的相同载体,但是插入片段不同。
  解决办法:重新挑取单克隆或者重新提取质粒。需要注意的是,重新进行PCR反应或者酶切鉴定仅能证明该克隆含有插入片段,并不足以证明模板的单一。
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(2) PCR产物不纯,如下图所示:
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在197bp前测序峰表现为杂或有明显套峰,且在197bp位置有一个高高的A峰,这个A峰标志着此PCR产物中有一个片段大小为200bp左右的小片段。
  注:PCR产物测序都是以A高峰终止。
  解决方法:对PCR产物切胶纯化,再进行测序。
 
Q-6.Poly结构的测序结果是怎样的? 返回顶端
A-6.以下图为例:
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以polyT为例,在polyA/T结构之后往往出现移码、双峰、套峰现象,而在polyG/C之后会往往导致测序信号的衰减或者直接中断。
  解决办法:使用反向引物对模板进行测序,测到该poly结构处,即可完成模板全长的拼接。如果是较长的PloyG/C,建议客户使用3.0试剂盒进行测序。
 
Q-7.含有回文结构的模板测序结果是怎样的? 返回顶端
A-7.以下图为例:
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位点94至137是一个回文结构,该结构导致后面的信号衰减,出现错误的判读。
  解决方法:使用反向引物对模板进行测序,测到该回文结构处,即可完成模板全长的拼接。
 
A-8.测序峰图为前双峰的结果是什么样的? 返回顶端
A-8. (1) 产物中含有小片段PCR产物;(2) 引物有两个结合位点,其中一个结果中断
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解决方法:换引物反向测序。
 
Q-9.测序峰图为后双峰是什么样的? 返回顶端
A-9.原因和解决方法同回文结构及插入后双峰。
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Q-10.无信号的结果:信号值(ATGC的平均值)皆小于100 返回顶端
A-10.以下图为例:
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测序无信号的判定:
  在确认引物、质粒抽提浓度、反应安排等条件无问题的情况下,测序结果峰型杂乱且信号值小于100的结果;此时则判定结果为测序无信号。两次测序无信号,我们会取消实验。
 
Q-11.飘峰:这是由于用3.0特殊试剂盒时碱基产生替代而出现碱基位移 返回顶端
A-11.以下图为例
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在用特殊试剂盒(3.0)时,会发生碱基替代,从而出现碱基位移的现象,即飘峰。
  解决方法:用普通试剂盒(3.1)测序消除碱基位移。
  注:3.0试剂盒只对局部高GC有效,对POlyA/T、重复结构(GT/GA等)无效,建议先用3.0试剂盒测序,然后用普通试剂盒进行纠正。
 
Q-12.没有任何干扰的结果 返回顶端
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