哺乳动物细胞表达服务(SC1259)

在过去二十年中, 重组蛋白(r-蛋白),特别是用于结构-功能分析的已纯化蛋白,在生物制药学领域的应用日益广泛。由于应用于该领域的r-蛋白基本上均需要翻译后修饰,以获得与天然分子相同的生物活性,而哺乳动物细胞自身具备蛋白折叠和翻译后修饰的功能,因此很多客户选择哺乳动物细胞蛋白表达系统,表达高质量的r-蛋白。

如果在您的实验过程中,出现关键性蛋白折叠问题或E.coli在充裕的时间内仍无法表达蛋白,或表达的蛋白质量不高等问题时,您可以尝试金斯瑞哺乳动物蛋白表达服务。我们的蛋白表达专家能在四周内提供mg级的哺乳动物细胞表达的蛋白 ,帮助您快速获得满意的实验结果。

服务优势

  • 能实现翻译后修饰及正确的蛋白折叠复性
  • 稳定及瞬时蛋白表达
  • 高效启动子(CMV, SV40)控制蛋白表达
  • 表达水平高
  • 大规模蛋白表达

服务内容

  • 载体构建及改进
    • 不论是稳定或是瞬时表达,金斯瑞均可将客户的cDNA克隆至客户或金斯瑞提供的哺乳动物细胞表达载体中。如果客户需要,金斯瑞可在每个表达载体中添加分泌信号或标签,以促进亲和层析后蛋白的最终修复。对于更复杂的方案,如:需要翻译后特殊修饰,形成复杂多聚体,多肽内或多肽间形成二硫键,或特殊的糖基化,金斯瑞推荐定制相关载体。我们还可以帮助客户标记需要的基因、基因片段或与荧光标记相融合(如GFP)。另外,我们能生产并鉴定高效的稳定细胞系,适合客户扩大生产规模以及进行cGMP生产。

  • 稳定基因表达符合长期生产需求
    • 整个实验操作流程,从转染,筛选和细胞分离,到评估初步克隆在无血清培养条件下的生产能力和适应性,提供长期稳定及规模可调的蛋白生产。
    • 根据客户的需求,金斯瑞将进行基因扩增,用于氨甲喋呤以及后续克隆及储存。我们也具备全面的遗传学研究能力,以及无论选择的介质是否存在的情况下生产的稳定性。金斯瑞提供细胞群储存服务,可用作prebanks预储备, masterbanks主要储备, and working cell banks以及工作元件储备。

  • (TGE) 瞬时表达
    • 稳定基因表达是将重组基因插入寄主基因组中,但鉴定及检测重组细胞系是个耗时、昂贵的过程,因此一些客户,尤其是转包合同或需大规模制备最优化细胞系的客户选择快速制备r-蛋白,快速蛋白制备(能提供mg(毫克)级至g(克)级)通过使用哺乳动物细胞TGE满足这些客户的需求。与稳定基因表达相比,TGE主要用于短期内制备r-蛋白,一般在10天内即可快速转染,无需质粒DNA的遗传性选择。我们的瞬时表达使用悬浮细胞,能轻松表达毫升至100L的蛋白。适合的表达载体构建完成四周左右,我们就能交付给客户表达产物:细胞培养液收集物或重组蛋白。如果客户需要,金斯瑞能将客户的目的基因,克隆入专为TGE系统所设计的高效表达载体中。

  • 工艺过程开发及扩大规模
    • 金斯瑞能优化表达过程以及表达的产物,并能对增长率,转种率, cell mass细胞群, 以及更改条件,促进特异化生成并测定生产体积等等方面进行全面的分析。金斯瑞同样能按比例降低生产规模,预测细胞表达量。金斯瑞自主研发的特异性、高生产效率的表达系统,是提供给客户高通量生产的良好保障。
    • 15N- 或13C-标签蛋白表达。

  • 纯化
    • 蛋白表达后,我们会富集培养液,收集上清或细胞,进行蛋白纯化。金斯瑞常用蛋白纯化方式为亲和柱纯化,同时也提供凝胶过滤、离子交换及疏水层析等纯化方法。初步纯化的蛋白经特殊蛋白酶去除纯化标签后,通过凝胶过滤进一步进行纯化。
    • 15N- 或13C-标签蛋白表达。

  • 蛋白鉴定
    • 每个订单完成后,我们的专家将确认金斯瑞交付的产品确实满足客户的需求。一般来说,金斯瑞会选取以下几个或全部检测方法鉴定表达的蛋白:染色后进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)或Native-PAGE(未变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测,蛋白浓度测定,Western blotting检测,吸收光谱检测,N末端序列测定,质谱分析,核磁共振波谱分析,以及活性检测,亲和层析,离子交换层析,凝胶过滤层析,疏水层析等方法纯化蛋白。

服务特点

服务 描述 交付内容
I. 重组载体构建及扩大化培养
  • 扩增/鉴定基因片段或合成目的基因,插入哺乳动物细胞表达载体
  • qPCR及测序检测确定亚克隆基因
  • 序列核实文件
  • 实验程序方案
II. 瞬时蛋白表达
  • 重组质粒转染目的细胞(293, CHO)
  • 瞬时表达
  • Western blot检测已表达的重组蛋白
  • 稳定细胞系的建立
  • 表达资料
  • 瞬时或稳定蛋白表达细胞系
  • 条件培养液
III. 小规模蛋白表达
  • 少量表达分析及优化表达
  • 细胞库扩大化培养
  • 1-5L的小规模蛋白表达
  • 胞浆
  • 表达资料
IV. 大规模蛋白制备
  • 细胞收集物
  • Western blot检测表达产物
  • 最高达100L的大规模蛋白制备
  • 胞浆
  • 表达资料
V. 蛋白纯化及鉴定
  • 活性检测,亲和层析,离子交换层析,凝胶过滤层析,疏水层析等方法纯化蛋白
  • 标签去除
  • Western blot, SDS-PAGE, 或测序等方法检测
  • 已纯化的蛋白
  • QC文件
  • 实验方案

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