并非所有抗体都适用于每种实验和条件，它们必须针对特定应用和物种进行验证。目前还没有“抗体验证”的标准方法，这极大地影响到了实验的重现性和可靠性。科研期刊和资助机构采取了多种措施来弥合这一差距。现在，很多机构要求明确说明如何验证特定用途的抗体。遗憾的是，抗体验证依然没有普遍公认的标准。因此，研究人员需要自行决定验证每一种抗体是否能够有效满足预期应用。
标准抗体验证方法包括蛋白质印迹、ELISA、流式细胞计和IHC。绝大多数研究人员对这些检测方法较为熟悉。验证过程可能较为耗时，因为研究人员或生产商必须验证抗体是否有效满足每一种应用。由于每种检测的条件都不相同，因此难度更大。例如，蛋白质印迹依赖于蛋白质的变性。因此，通过蛋白质印迹验证的抗体在变性条件下可有效发挥作用，但可能无法识别原生构象的抗原（即ELISA）。1同样，通过原生蛋白质亲和力验证的抗体也无法结合变性或固定后的同一种抗原。
以上方法在抗体验证中发挥着不可或缺的作用。但我们不能完全依赖这些方法，因为它们并不能代表不断扩大的应用领域。通过采用其他验证技术，可以提高抗体验证的可信度。
为了针对解决基本抗体验证的种种不足，一群科学家最近聚集在一起，“为抗体验证提出了一系列标准指南”。2他们建议，除了基本的抗体验证方法外，研究人员应开始仰仗其他概念性支柱。这其中包括遗传策略、独立抗体策略和标记蛋白质表达。2
遗传策略：CRISPR-Cas9以及其他更多
基因策略包括CRISPR-Cas9，RNAi和siRNA基因敲除等技术，并与蛋白质检验结合使用。这些方法在敲除或敲低适当的基因后可检测出被研究抗体的任何非特异性结合。如果抗体具有特异性，则在敲除和敲低的细胞系中应分别检测到该抗体无信号或信号减弱。
独立抗体验证法
独立抗体的使用是另一种能够检测出非特异性结合的方法。独立抗体法采用两种不同的（独立的）抗体，它们结合相同的抗原但表位不同。因此，这两种抗体均应表现出相同的检测规律且不存在脱靶结合。2此项技术要求使用多份样品进行检验，以便与可变目标蛋白表达形成对照，因此变得非常耗时且成本高昂。此外，该验证技术还依赖于可在同一目标蛋白上识别不同表位的多种抗体的可用性。金斯瑞在其单克隆抗体开发服务中提供了表位分选，包括用于蛋白质抗原的“独立抗体”。
标记蛋白质表达
分析标记目标蛋白的检测情况也是测量抗体非特异性结合的一种方法。该方法使用亲和力标记（即FLAG）或荧光蛋白（即GFP）来对目标蛋白进行修饰。然后，与独立抗体验证法相似，用接受验证的抗体的检测规律与标记特异性抗体的检测规律进行比较。虽然比较直观，但该方法存在的一个问题是如何确保标记蛋白质的表达可达到内源性水平，因为“过表达会掩盖脱靶结合事件的检测”。2
重组抗体用于替代单克隆抗体？
最近一项关于抗体验证的行动呼吁与建议研究人员只使用重组抗体，而不是多克隆甚至单克隆抗体。单克隆抗体的生产制备使用杂交瘤细胞系。遗憾的是，杂交瘤细胞系会全部死亡、会丢失抗体编码基因、或者从冷冻保存中取出时便停止生长。3此外，杂交瘤生成的单克隆抗体会与不止一个标靶相结合。因此，为杂交瘤编码的抗体确定序列并通过重组方式生成抗体才能克服这些问题。再者，与单独使用上述验证方法相比，重组抗体由于存在明确定义的序列而能够提供另一层的验证。3
这些额外的验证方法建议 "提供抗体与其靶标结合的证据，在大多数情况下，它们还应该允许在测试条件下评估潜在的交叉反应"。2但旧的策略和新的策略极有可能需要组合使用才能进行妥善的抗体验证。
在围绕抗体的所有这些问题面前，您如何选出合适的方法？
首先，您需要决定自己将在哪种检验测定中使用抗体。例如，CRISPR-Cas9方法不涉及目标蛋白的修饰，而且能够验证抗体缺乏与其他蛋白质的交叉反应。因此，您可以使用此项技术来为多种不同的检验测定进行抗体验证，包括蛋白质印迹、IHC、免疫细胞化学（ICC）、流式细胞计、ELISA、免疫沉淀反应（IP）、染色质免疫沉淀反应（ChIP）以及反相蛋白测定等。2但由于修饰蛋白质的表达存在难度，因此仅建议对蛋白质印迹、IHC、ICC和流式细胞计使用标记蛋白质表达法来进行抗体验证。
其次，研究人员必须清楚了解这些验证方法的样品限制。例如，CRISPR-Cas9/KO和标记蛋白质表达法都不能用于验证人体组织样品和体液（如血浆和血清）中的抗体。2这是因为，与细胞系不同，您无法在人体内进行遗传基因操纵。
最后，无论抗体提供商使用了哪种抗体及其对应的验证方法，研究人员都必须在具体的应用或样品背景下执行至少一种验证策略。2
针对特定应用和物种验证每种抗体是获得可重复和可靠结果的关键。本文信息将指导您就实验室所采用的合适方法做出决策。在抗体验证或其他应用方面如需进一步的协助，敬请访问金斯瑞抗体技术资源。
改编自BitesizeBio代表金斯瑞编制的文章内容。
Bordeaux, J., et al. Antibody validation. BioTechniques. 2010.
Uhlen M, et al. A proposal for validation of antibodies. Nat Methods. 2016.
Bradbury A., et al. Standardize antibodies used in research. Nature. 2015.
