稳定细胞系用于分析 在研究中被广泛使用,作为发现新途径的工具,或用于发现治疗方法。细胞基础分析的开发需要一个经过验证表达感兴趣基因的单克隆稳定细胞系。金斯瑞能够使用我们基于慢病毒的平台细胞系开发,开发具有难以转染的细胞和高表达难以表达基因的重组稳定细胞系。金斯瑞也可以使用非慢病毒方法开发稳定细胞系。以下是一些基于应用的案例研究,展示了金斯瑞开发的稳定细胞系。
通过流式细胞术检测微核,可以对非整倍体和染色体破裂原进行遗传毒性筛选。然而,由于细胞毒性引起的凋亡体的存在,而非遗传毒性,这种类型的分析往往会产生假阳性结果。
为了克服假阳性结果,一家大型制药公司的科学家们开发了一种更健壮的分析方法,通过在FACS基础的微核分析中使用一个抗凋亡的稳定细胞系(在TK6细胞中过表达BCL-xL)。此外,还评估了非整倍体标记物磷酸化组蛋白H3(H3)和双链断裂标记物γH2AXser139(γH2AX DSB)的存在,以进一步验证引起微核的化合物。
金斯瑞的基于慢病毒的稳定细胞系服务成功提供了关键的重组稳定细胞系,用于开发这种高度特异的遗传毒性分析。
qPCR分析显示稳定克隆中BCL-xL的mRNA表达高于未转染的对照组。
通过Western blot确认了单个稳定细胞中BCL-xL的蛋白表达
Clastogen (Etoposide) | Aneugen (Vinblastine) | Cytotoxicant (Tunicamycin) | |
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Micronucleus/ toxicity profile |
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H3-P (Aneugen marker) profile |
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上述数据显示,野生型和BCL-xL过表达的TK6细胞系在细胞生长和毒性方面表现出相似的水平。此外,与野生型相比,TK6-BCL-xL表现出更少的凋亡体。BCL-xL细胞系对断裂原(依托泊苷)和非整倍体原(长春碱)产生了阳性反应,但对细胞毒性物质(吐尼卡霉素)没有产生阳性反应。此外,断裂原显示出γH2aX DSB水平升高,而非整倍体原显示出H3-P水平升高,细胞毒性物质则没有使γH2aXDSB或H3-P水平升高。
Richard A. Spellman, et al., "Strategies to Avoid Misleading Positives and to Identify Genotoxic Mechanisms in the Flow Cytometric In Vitro Micronucleus Assay in TK6 Cells" (poster presentation, 2014 Annual Genetic Toxicology Association Meeting, Newark, DE, May 7-8, 2014), accessed September 4, 2014 http://www.gta-us.org/scimtgs/2014Meeting/posters2014.html#poster1