新思路!金斯瑞助力CRISPR技术应用于靶向PD1的CAR-T治疗

CAR-T发展过程中,科学家利用基因工程的魔法,不断优化改造T细胞,增加其实效性、持续性、安全性、通用性等。以简单快捷的CRISPR为代表的基因编辑技术的崛起,也提供了改造T细胞的新思路,在CAR-T疗法中逐渐展露锋芒。

看这一篇文章就够了!快跟着小编了解CAR-T的前世今生与未来前景吧!

什么是CAR-T细胞?嵌合抗原受体T细胞疗法(CAR-T疗法)作为细胞治疗中的临床疗效耀眼的佼佼者,通过对T细胞进行基因工程修饰,使其表达CAR,从而独立于MHC呈递,特异性识别肿瘤抗原,最终激活T细胞并介导癌细胞的杀伤。

CAR-T细胞疗法在包括侵袭性B细胞淋巴瘤为代表的血液恶性肿瘤治疗中表现突出。2017年8月,美国食品和药物管理局(FDA)首次正式批准针对CD19的CAR-T细胞疗法Kymriah上市,该疗法在治疗侵袭性急性淋巴细胞白血病中,约76%的患者完全缓解[1-2]

CAR-T细胞进阶史1989年,第一代CAR-T只有一个胞内信号传导结构域(主要是CD-3ζ或FcRγ),仅在T细胞表达单链抗体,靶向肿瘤细胞表面抗原分子,但存续时间短,限制了其发挥功效[3]

第二、三代,将共刺激信号分子(CD28、4-1BB等)组装进CAR,提升T细胞活化、存续和扩增[4]。第四代CAR-T追加引入促炎细胞因子(IL-12等),在具有免疫抑制性的肿瘤微环境中,通过释放促炎因子招募并活化更多免疫细胞,引起更广泛的抗肿瘤免疫效应。第五代通用型CAR-T通过敲除异体T细胞可能造成免疫排斥的基因,为CAR-T疗法的大规模生产和即时应用提供了可能。

基于病毒转染技术的CAR-T生产传统技术路线中,通过慢病毒载体(LV)将CAR序列转染进T细胞,从而进行基因组整合,获取CAR-T细胞,这种方法可确保CAR构造的有效整合和稳定表达。然而,在CAR-T细胞生成中使用病毒载体,存在CAR序列可能产生随机基因组整合的缺点,例如潜在的插入突变、异种CAR表达、CAR表达沉默[5-6]

同时,病毒转染技术操作复杂、成本高、周期长,增加了CAR-T疗法造价和时间成本,限制了后续CAR-T疗法临床普及应用。

新方法!利用CRISPR靶向插入CARCRISPR/Cas9为CAR结构靶向特定目标基因提供新思路。CRISPR核糖核蛋白复合物由gRNA和Cas9蛋白组成,gRNA中tracrRNA部分与Cas9结合,crRNA部分可识别特定的目标序列,并通过Cas9对目标序列进行剪切。剪切产生双链断裂后,细胞修复机制被激活,可通过非同源末端连接(NHEJ)实现基因敲除,或通过同源性定向重组(HDR),同时加入同源模板实现基因敲入。科学家通过HDR实现长片段DNA序列的靶向插入,并运用于CAR-T细胞的生产。例如,Eyquem etal.利用CRISPR/Cas9(Cas9 mRNA和gRNA)将特异性识别CD19 的CAR,靶向地插入TRAC(编码TCRα链)基因座[7]。该应用中, CD19-CAR DNA供体模板通过免疫原性、整合风险更低的腺相关病毒(AAV6)载体递送进T细胞,从而可以规避上述慢病毒载体可能存在的风险。

金斯瑞助力CRISPR技术应用于靶向PD1的CAR-T治疗

近期,medRxiv预印本中,Zhang等针对AAVS1安全位点和PD1这两个基因位点,利用CRISPR/Cas9成功开发了CAR-T细胞。该研究中使用了金斯瑞合成的gRNA。Zhang等将非病毒的CAR的DNA模板(包含CD19抗原识别结构域、4-1BB-CD3ζ信号结构域(19bbz)),通过CRISPR/Cas9靶向插入AAV1基因座,由此生产的CAR-T细胞,与原慢病毒转染模式生产的CAR-T细胞相比,具备类似的扩增能力和肿瘤杀伤能力。同样的,通过类似的CRISPR/Cas9技术,生产包含识别PD1的CAR的T细胞,与原慢病毒转染模式生产的CAR-T细胞相比,zz,更节省时间与经费成本。接下来,另一项临床试验(NCT04213469)旨在评估利用CRISPR/ Cas9技术生产的、靶向PD1的CAR-T细胞在治疗复发/难治性(r/r)侵袭性B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)的安全性和有效性。Zhang等通过电转的方式将核糖核蛋白复合物(spCas9 / PD1-crRNA:tracrRNA)和非病毒CAR DNA模板,转入从患者获取的T细胞。用该方法获得的PD1-19bbz CAR-T细胞治疗没有细胞因子释放综合症和神经毒性在内的严重不良事件,并使两名代表性患者在接受3个月治疗后完全缓解[6]。目前,CRISPR/Cas9基因编辑系统在自体和同种异体CAR-T细胞的开发中的应用发展迅猛,为基于非病毒敲入策略,进行CAR-T细胞基因编辑提供了安全有效的方案。

金斯瑞提供从筛选、研发到临床申报相关的CRISPR试剂,包含gRNA文库、质粒/病毒/RNP(sgRNA)递送体系、DNA供体模板(ssDNA)、CRISPR编辑细胞系等,支持细胞/基因治疗、基因功能研究、靶点/药物筛选等研究。

金斯瑞期待以严苛的产品质量、专业的技术支持、领先的技术与周期,助力您的项目快速高效的推进。

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