CAR-T发展过程中，科学家利用基因工程的魔法，不断优化改造T细胞，增加其实效性、持续性、安全性、通用性等。以简单快捷的CRISPR为代表的基因编辑技术的崛起，也提供了改造T细胞的新思路，在CAR-T疗法中逐渐展露锋芒。
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什么是CAR-T细胞？嵌合抗原受体T细胞疗法（CAR-T疗法）作为细胞治疗中的临床疗效耀眼的佼佼者，通过对T细胞进行基因工程修饰，使其表达CAR，从而独立于MHC呈递，特异性识别肿瘤抗原，最终激活T细胞并介导癌细胞的杀伤。
CAR-T细胞疗法在包括侵袭性B细胞淋巴瘤为代表的血液恶性肿瘤治疗中表现突出。2017年8月，美国食品和药物管理局（FDA）首次正式批准针对CD19的CAR-T细胞疗法Kymriah上市，该疗法在治疗侵袭性急性淋巴细胞白血病中，约76％的患者完全缓解[1-2]。
CAR-T细胞进阶史1989年，第一代CAR-T只有一个胞内信号传导结构域（主要是CD-3ζ或FcRγ），仅在T细胞表达单链抗体，靶向肿瘤细胞表面抗原分子，但存续时间短，限制了其发挥功效[3]。
第二、三代，将共刺激信号分子（CD28、4-1BB等）组装进CAR，提升T细胞活化、存续和扩增[4]。第四代CAR-T追加引入促炎细胞因子（IL-12等），在具有免疫抑制性的肿瘤微环境中，通过释放促炎因子招募并活化更多免疫细胞，引起更广泛的抗肿瘤免疫效应。第五代通用型CAR-T通过敲除异体T细胞可能造成免疫排斥的基因，为CAR-T疗法的大规模生产和即时应用提供了可能。
基于病毒转染技术的CAR-T生产传统技术路线中，通过慢病毒载体（LV）将CAR序列转染进T细胞，从而进行基因组整合，获取CAR-T细胞，这种方法可确保CAR构造的有效整合和稳定表达。然而，在CAR-T细胞生成中使用病毒载体，存在CAR序列可能产生随机基因组整合的缺点，例如潜在的插入突变、异种CAR表达、CAR表达沉默[5-6]。
同时，病毒转染技术操作复杂、成本高、周期长，增加了CAR-T疗法造价和时间成本，限制了后续CAR-T疗法临床普及应用。
新方法！利用CRISPR靶向插入CARCRISPR/Cas9为CAR结构靶向特定目标基因提供新思路。CRISPR核糖核蛋白复合物由gRNA和Cas9蛋白组成，gRNA中tracrRNA部分与Cas9结合，crRNA部分可识别特定的目标序列，并通过Cas9对目标序列进行剪切。剪切产生双链断裂后，细胞修复机制被激活，可通过非同源末端连接（NHEJ）实现基因敲除，或通过同源性定向重组（HDR），同时加入同源模板实现基因敲入。科学家通过HDR实现长片段DNA序列的靶向插入，并运用于CAR-T细胞的生产。例如，Eyquem etal.利用CRISPR/Cas9（Cas9 mRNA和gRNA）将特异性识别CD19 的CAR，靶向地插入TRAC（编码TCRα链）基因座[7]。该应用中， CD19-CAR DNA供体模板通过免疫原性、整合风险更低的腺相关病毒（AAV6）载体递送进T细胞，从而可以规避上述慢病毒载体可能存在的风险。
近期，medRxiv预印本中，Zhang等针对AAVS1安全位点和PD1这两个基因位点，利用CRISPR/Cas9成功开发了CAR-T细胞。该研究中使用了金斯瑞合成的gRNA。Zhang等将非病毒的CAR的DNA模板（包含CD19抗原识别结构域、4-1BB-CD3ζ信号结构域（19bbz）），通过CRISPR/Cas9靶向插入AAV1基因座，由此生产的CAR-T细胞，与原慢病毒转染模式生产的CAR-T细胞相比，具备类似的扩增能力和肿瘤杀伤能力。同样的，通过类似的CRISPR/Cas9技术，生产包含识别PD1的CAR的T细胞，与原慢病毒转染模式生产的CAR-T细胞相比，zz，更节省时间与经费成本。接下来，另一项临床试验（NCT04213469）旨在评估利用CRISPR/ Cas9技术生产的、靶向PD1的CAR-T细胞在治疗复发/难治性（r/r）侵袭性B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）的安全性和有效性。Zhang等通过电转的方式将核糖核蛋白复合物（spCas9 / PD1-crRNA：tracrRNA）和非病毒CAR DNA模板，转入从患者获取的T细胞。用该方法获得的PD1-19bbz CAR-T细胞治疗没有细胞因子释放综合症和神经毒性在内的严重不良事件，并使两名代表性患者在接受3个月治疗后完全缓解[6]。目前，CRISPR/Cas9基因编辑系统在自体和同种异体CAR-T细胞的开发中的应用发展迅猛，为基于非病毒敲入策略，进行CAR-T细胞基因编辑提供了安全有效的方案。
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