通过RT-PCR检测mRNA拷贝数
![通过RT-PCR检测mRNA拷贝数](/gsimgs/subject/circrna-case-study-1-1.jpg)
通过荧光强度检测mRNA蛋白表达量
![通过荧光强度检测mRNA蛋白表达量](/gsimgs/subject/circrna-case-study-1-2.jpg)
实验方法:
将编码GFP的环状RNA(无修饰)和线性mRNA(100% N1-me-pseU修饰)以同等的mol剂量转染A549细胞,用qPCR检测编码mRNA的丰度,用流式细胞术检测GFP蛋白的荧光强度。
实验结论:72小时后
- 环状RNA的拷贝数是线性mRNA的4倍,稳定性好,降解慢
- 环状RNA的蛋白表达量是线性mRNA的3倍,表达时间长,表达量高
一站式服务,交付快
涵盖基因合成、质粒制备、环化效率高,纯度高
自研的环状RNA载体、提升蛋白表达量
较之线性mRNA更稳定,免疫原性更低
无需加帽、加尾等修饰,服务名称 | 长度 | 交付量 | 纯化方式 | QC | 交付形式 | 周期 |
---|---|---|---|---|---|---|
定制化 环状RNA合成 |
目标序列:100 bp - 4 kb 全长序列:<5 kb |
100 μg – 20 mg | HPLC | 研究级 - 标准 研究级 - 升级 |
1mM 柠檬酸钠缓冲液, pH6.5(默认) RNase-Free Water(可选) |
3周起 |
环状RNA现货 (eGFP / F-Luc) |
eGFP环状RNA: 1,644nt F-Luc环状RNA: 2,577nt |
25 / 50 / 100 / 200 μg | HPLC | 研究级 - 标准 | 5个工作日 |
* IRES: 默认 CVB3 或客户提供定制化IRES序列
告知我们您的ORF或IRES序列
金斯瑞将为您的环状RNA设计包含T7启动子, PIE, IRES和ORF
基因合成至质粒制备
一站式完成环状RNA制备的全部前置步骤
环状IVT mRNA制备(RUO级别)
μg至mg级别,采用反相高效液相色谱的等纯化方式,并进行QC
QC | 项目 | 检测方式 | 检测标准 | 研究级 - 标准 | 研究级 – 升级 |
---|---|---|---|---|---|
鉴定 | 外观 | 视觉观测 | 澄清无异物 | ||
RNA长度 | Bioanalyzer | 条带位置匹配对应长度 | |||
鉴定 | RNaseR降解测试 | 不会被RNaseR降解 | |||
RNA含量 | UV吸收 | 目标值 ± 5% | |||
PH | PH试纸/PH计 | 目标值 ± 0.5 | |||
缓冲液规格 | 按客户提供详情 | - | |||
纯度 | A260/280 | UV检测 | 1.70 ~ 2.30 | ||
HPLC检测 | HPLC | ≥80% | |||
杂质 | 蛋白质残留 | Nano Orange染料检测 | ≤ 1% | ||
质粒DNA残留 | qPCR | ≤ 0.1% | |||
安全性 | 内毒素 | 半定量 | < 10EU/mg | ||
内毒素 | 定量 | < 10EU/mg | |||
生物负载 | 直接接种 | 72小时内不生长 |
通过RT-PCR检测mRNA拷贝数
通过荧光强度检测mRNA蛋白表达量
实验方法:
将编码GFP的环状RNA(无修饰)和线性mRNA(100% N1-me-pseU修饰)以同等的mol剂量转染A549细胞,用qPCR检测编码mRNA的丰度,用流式细胞术检测GFP蛋白的荧光强度。
实验结论:72小时后
实验方法:
比较线性mRNA,常规环状RNA*,金斯瑞环状RNA(自研技术)三种编码eGFP的mRNA,转染A549细胞后蛋白表达量。
* Wesselhoeft, R.A., Kowalski, P.S. & Anderson, D.G. Engineering circular RNA for potent and stable translation in eukaryotic cells. Nat Commun 9, 2629 (2018)
实验结果:
金斯瑞环状RNA在开始的蛋白表达量和积累的蛋白表达量上,都有更高的表达水平。
实验方法:
比较常规环状RNA*,金斯瑞环状RNA(自研技术)两种编码eGFP的mRNA,转染A549细胞和HEK293T细胞后,通过流式细胞术检测蛋白表达量。
* Wesselhoeft, R.A., Kowalski, P.S. & Anderson, D.G. Engineering circular RNA for potent and stable translation in eukaryotic cells. Nat Commun 9, 2629 (2018)
实验结果:
基于自研技术的金斯瑞环状RNA,在经过HPLC纯化后,在两个细胞上的蛋白表达量均高于常规环状RNA 2-4倍。
实验方法:
将不同mRNA转染A549细胞(InvivoGen),IL6水平检测:Abcam Human IL-6 ELISA Kit,IFN-α水平检测:QUANTI-Luc/Gaussia kit,NF-Kb水平检测:QUANTI-Blue kit。
实验结果:
较之线性mRNA,环状RNA引起的细胞因子上升幅度更低,免疫原性更低。
环状RNA是一种单链的mRNA分子,5端和3端链接形成了共价闭环,不易受RNA外切酶影响,表达更稳定,不易降解。环状RNA被发现天然存在于哺乳动物细胞中,在很多生物学过程中扮演重要角色。
环状RNA自身优势为基于其开发的mRNA疗法带来的收益:
现阶段环状RNA的应用:
综上,环状RNA的研究正在各个领域快速发展,从而为提升人类健康的医疗应用提供更多新思路。